Clotrimazole

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Plasmidlinearisierung Dier PCR-Produkte wurden in den pGET-T Vektor Plasmid ; nach dem in Kap. 3.5 Protokoll kloniert. Nach Vermehrung und Gewinnung der Plasmide wurden diese Linearisiert. Hierzu wurde die Restriktionsendonuklease Nco I für die Transkription mit der Sp6-RNA-Polymerase, und das Not I Restriktionsenzym für die Transkription mit der T7-RNA-Polymerase verwendet. Die Lineariesierung des Plasmids erfolgte wie in Kap. 3.5 Doppelverdau ; beschrieben mit dem Unterschied, dass pro 5 l Plasmid ein getrennter Ansatz für Not I und Nco I hergestellt wurde Tabelle 19 ; . Tabelle 19: Zusammensetzung des Ansatzes für die Plasmidlinearisierung mit den Restriktionsendonukleasen Not I NcoI Komponenten DEPC-Wasser NEBuffer 3 für Not I Restriktase ; NEBuffer 4 für Nco I Restriktase ; Not I 10 U Nco I 10 U BSA In vitro Transkription Für die Herstellung einer Digoxigenin-markierten cRNA-Sonde Transkription ; wurde der DIG-RNA-Labeling Mix Roche Diagnostics GmbH, Mannheim ; verwendet. Hierfür wurde folgende Reaktion angesetzt Tabelle 20 ; . Die Transkriptionsansätze wurden eine Stunde bei 37 oC inkubiert. Zum Abbrechen der enzymatischen Reaktionen und Fällung Not I Ansatz in l ; 10 --1 --2 Nco I Ansatz in l ; 12 --2 --1.
Die in vielen Spezies vorkommenden Cholinesterasen gehören zur Klasse der SerinHydrolasen. Beim Menschen unterscheidet man zwischen der hochspezifischen Acetylcholinesterase AChE, E.C. 3.1.1.7 ; und der unspezifischen Butyrylcholinesterase Serumcholinesterase, BChE, E.C. 3.1.1.8 ; .[140] Beide Enzyme hydrolysieren Acetylcholin zu Essigsäure und Cholin. Die Acetylcholinesterase ist ein physiologisch essentielles Enzym aus der Nervenreizleitung. Die Butyrylcholinesterase ist dagegen ein Leber- und Plasmaenzym. Ihre genaue physiologische Bedeutung ist noch unklar, da kein spezifisches Substrat bekannt ist. Es ist ein seit langem bekanntes und unter anderem auch militärisch genutztes Faktum, daß verschiedene Organophosphate starke Inhibitoren der AChE sind. Diese Organophosphate reagieren nach einem mit dem hochreaktiven SerinRest im aktiven Zentrum der AChE und bilden ein kovalentes Addukt suicide inhibition ; .[140] Da cycloSal-Nucleosidmonophosphate reaktive Organophosphate darstellen, sind auch sie potentielle Inhibitoren der AChE. Untersuchungen an einer Vielzahl von cycloSalPhosphattriestern konnten zeigen, daß eine Reihe diesen Verbindungen gute Inhibitoren der BChE, jedoch nicht der AChE sind.[139, 141] Dabei konnte eine Struktur-Aktivitäts-Beziehung aufgestellt werden. Insbesondere die Konfiguration Phosphoratom ist von entscheidender Bedeutung. So konnte bewiesen werden, daß in der Regel lediglich eines der beiden Diastereomere der cycloSal-Phosphattriester die BChE inhibiert, während das andere Diastereomer keinerlei inhibitorische Aktivität besitzt. Auch der Substituent in der 3'-Position ist von Bedeutung für die inhibitorischen Eigenschaften. Sperrige Substituenten in dieser und ddavp.